Выявление перспективных гибридов Solanumtuberosum с высоким уровнем устойчивости к фитофторозу

Проблема контроля распространения фитофтороза, возбудителем которого является оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, в производственных посадках картофеля не теряет своей остроты с момента фиксации первых эпифитотий болезни. История знает немало примеров, когда этот патоген сыграл трагическую роль в жизни людей. В 1843 году фитофтороз вызвал значительные поражения картофеля в США, а уже в 1845-м начал распространяться по территории Европы, что привело к голоду и массовой эмиграции из Ирландии, где картофель был основным продуктом питания.

В современную технологию возделывания картофеля интегрированы и постоянно совершенствуются различные комплексные меры предупреждения данного заболевания, которые применяются практически на всех этапах производственного цикла, включая хранение, подготовку к посадке, уход и уборку.

При благоприятных условиях для развития фитофтороза без своевременного применения химических препаратов большинство сортов подвержены сильному поражению. В настоящее время потери урожая из-за фитофтороза оцениваются в 10–15% от общего мирового годового производства картофеля. Экономическая стоимость потерянного урожая в совокупности с расходами на защиту растений составляет более 10 млрд долл. США в год. Стоимость пестицидов для контроля фитофтороза может составлять от 10 до 25% рыночной стоимости урожая картофеля в развитых странах. Поэтому наличие высокой генетически обусловленной устойчивости к фитофторозу — один из основных критериев при подборе исходных родительских форм для использования в селекции и одна из важнейших характеристик сорта. В связи с этим необходимо на этапе предселекции не только отбирать высокоустойчивые к патогену формы, но и на их основе создавать новые генетические источники, которые характеризуются высоким уровнем и стабильностью проявления хозяйственно ценных признаков.

Оценку устойчивости картофеля к фитофторозу проводят непосредственно в поле и при помощи искусственного заражения в лабораторных и полевых условиях. Естественные эпифитотии P. infestans могут быть использованы для скрининга картофеля на устойчивость к фитофторозу. Но такая оценка не может быть точной, так как на развитие эпифитотий значительное влияние оказывают факторы внешней среды, такие как температура, относительная влажность и осадки.

Таким образом, степень проявления инфекции в поле может варьироваться от года к году. Использование искусственной инокуляции дает более надежные результаты оценки устойчивости. Надежно выявить генетические источники, обладающие высоким уровнем фитофтороустойчивости, позволяет совмещение лабораторных тестов и скрининга в полевых условиях. Лабораторное заражение создает максимально благоприятные условия для развития инфекции, и, в отличие от заражения в поле, результат не определяется условиями окружающей среды. При искусственном заражении в лаборатории можно оценить устойчивость к широкому спектру рас патогена, которые могут быть нетипичными для отдельных территорий. При искусственном заражении создается повышенная вирулентность среды, что позволяет более точно оценить уровень как горизонтальной (при использовании сложного инокулюма), так и вертикальной устойчивости.

Сочетание полевого скрининга и искусственного заражения в лаборатории позволяет ускорить отбор устойчивых генотипов в самом начале селекционного процесса. При этом лабораторный скрининг, включающий искусственное заражение отдельных клубней и листьев, дает результаты, сопоставимые с оценкой в полевых условиях в период естественных эпифитотий фитофтороза, и позволяет выявить устойчивые гибриды.

Горизонтальная (полевая) устойчивость к фитофторозу относится к аддитивно наследуемым полигенным признакам. Вертикальная (расоспецифическая) устойчивость определяется наличием доминантных Rpi-генов (генов устойчивости к P. infestans), которые были выявлены у диких видов картофеля. Для поражения растений картофеля P. infestans использует эффекторные белки, многие из которых содержат мотив RXLR. R-белки растений, кодируемые генами Rpi, распознают эффекторные белки RXLR, что останавливает прогрессирование инфекции. Данная система ответа объясняет специфическую устойчивость определенных генотипов хозяина к различным штаммам патогенов.

Выявление устойчивых к фитофторозу генотипов Solanum demissum из Мексики способствовало селекции культурного картофеля в Европе в начале XX века. Однако внедрение генов Rpi из S. demissum оказалось малоэффективным — в большинстве случаев P. infestans смогла преодолеть устойчивость, так как R-гены обеспечивают защиту от определенных рас P. infestans, и некоторые расы патогена оказались вирулентными по отношению ко всем изначально идентифицированным и внедренным от диких видов R-генам.

На современном этапе селекционерами в кооперации со специалистами по защите растений, генетиками, молекулярными биологами непрерывно ведется поиск новых генетических источников устойчивости к P. infestans среди большого разнообразия ранее не задействованных в селекционном процессе видов картофеля.

К настоящему времени идентифицированы более 70 Rpi-генов у 32 видов Solanum. При этом у диких видов могут встречаться как единичные Rpi-гены, так и несколько генов одновременно. Например, S. huancabambense, S. pinnatisectum, S. schenckii и S. tarijense имеют по 2 функциональных Rpi-гена, S. hjertingii и S. chacoense — 3, S. edinense, S. venturii и S. stoloniferum — 4, S. berthaultii и S. bulbocastanum — 5, S. demissum — 14.

Rpi-гены были картированы кластерами на I, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X и XI хромосомах картофеля. Все вышеперечисленные виды могут быть потенциальными донорами новых Rpi-генов и, таким образом, более широко включаться в программы скрещиваний. Использование надежных молекулярных маркеров, сцепленных сRpi-генами, в рамках маркер-опосредованной селекции ускоряет процесс отбора растений, несущих данные гены. Такой подход для широкого скрининга перспективных форм картофеля является наиболее информативным для их изучения и дальнейшего использования.

Остро стоит проблема преодоления устойчивости к фитофторе у вновь создаваемых сортов и гибридов. Наличие нескольких Rpi-генов одновременно может способствовать сохранению устойчивости.

В ФИЦ картофеля им. А.Г. Лорха значительное внимание уделяется оценке и созданию генотипов картофеля с высокой устойчивостью к фитофторозу. В генетической коллекции картофеля сформирована группа образцов (питомник фитофтороустойчивых форм), которые наряду с комплексом хозяйственно ценных признаков характеризуются устойчивостью к фитофторозу на уровне, сопоставимом с лучшими мировыми стандартами. Многолетнее их изучение по признаку устойчивости к фитофторозу позволило выделить формы, отличающиеся стабильно высоким уровнем этого признака.

Цель работы — выявить перспективные гибриды с высоким уровнем устойчивости к P. infestans, используя данныемноголетней комплексной оценки генетической коллекции картофеля.

Для осуществления поставленной цели проводили многолетнюю лабораторную оценку фитофтороустойчивости клубней и листьев, скрининг в полевых условиях в отсутствие искусственного заражения, выявление молекулярных маркеров Rpi-генов.

Материалы и методы исследования

Исследования выполнены на базе опытного поля ЭБ «Коренево» ФГБНУ «ФИЦ картофеля им. А.Г. Лорха» (Московская обл., Люберецкий р-н) с 2015 по 2023 год. Агротехника общепринятая, без искусственного орошения. Обработку фунгицидными препаратами не проводили. Материалом для исследований стали гибриды картофеля из генетической коллекции, сформированной в ФИЦ, полученные в ходе реализации собственных селекционных программ.

Ежегодно (начиная с 2015 года) для поддержания коллекции гибриды высаживались однорядковыми 10-клубневыми делянками в однократной повторности по схеме 70 х 30 см с расстоянием между разными образцами 1,5 м.

Оценка и отбор гибридного материала по комплексу хозяйственно полезных признаков и устойчивости проводились в соответствии с методическими указаниями по технологии селекционного процесса картофеля, методикой исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету.

Для оценки лабораторной устойчивости наиболее типичные развитые листья собирали со средней части стебля. При искусственном заражении в условиях лаборатории использовали инокулюм, состоящий из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7…xyz рас фитофтороза. Для заражения готовили суспензию, содержащую 25 конидий (× 120), что соответствует наличию 30–35 тыс. зооспор в 1 мл. Период инфицирования составлял 24 часа.

Первый учет пораженности проводили через трое суток после инокуляции, второй учет — через сутки после предыдущего. Завершали учет на 5–6-е сутки, степень поражения каждого листа оценивали по девятибалльной шкале: 9 — поражение отсутствует (высокая устойчивость), 1 — поражена вся поверхность. При оценке учитывались выраженность развития мицелия и пораженная доля площади листа.

При оценке устойчивости клубней для заражения использовали целые клубни, которые выдерживали в суспензии с концентрацией 20–25 зооспорангий в поле зрения микроскопа (при 120-кратном увеличении) в течение 3 мин. После этого клубни помещали в камеру, в которой поддерживали влажность 80–90% и температуру 18–20 °С. Камеру периодически проветривали. Учет производили на 15-е сутки с момента заражения. Определяли степень поражения поверхности клубня и глубину проникновения некроза путем разреза через пятно. Оценка производилась по девятибалльной шкале с учетом этих двух показателей.

Визуальную полевую оценку наличия и степени поражения растений картофеля фитофторозом проводили в два этапа — при появлении первых признаков болезни на неустойчивых формах и через 7–10 дней после. Руководствовались девятибалльной шкалой (табл. 1).

Картофель сорта Жуковский ранний (восприимчивый) был использован в качестве отрицательного контроля. Картофель сорта Sarpo Mira (устойчивый) использовался в качестве положительного контроля, так как у него подтверждено наличие 5 генов устойчивости к фитофторозу.

Выявление молекулярных маркеров генов устойчивости методом ПЦР

В исследовании были использованы ранее опубликованные молекулярные SCAR-маркеры Rpi-генов (R1, R2/Rpi-blb3, R3a, R3b, Rpi-blb1 = Rpi-sto1). Выделение ДНК в соответствии с методом CTAB.

ПЦР проводили по стандартному протоколу. Объем реакционной смеси составил 25 мкл. В состав реакционной смеси входили следующие компоненты: однократный буфер, 1 единица активности Taq-полимеразы, 5 mM хлорида магния, 0,25 mM смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,2 μM каждого из праймеров, геномная ДНК. Амплификация производилась в приборе Thermo Fisher (США) при температуре отжига, соответствующей каждой паре праймеров (R1, Rpi-blb1 = Rpi-sto1 — 65 С; R3a, R3b — 64 С, R2 — 54 С).

Разделение ПЦР-продуктов производили методом электрофореза в агарозном геле (концентрация агарозы — 1,5%).

Полученные данные обрабатывали статистически при помощи Microsoft Excel (США).

Результаты и обсуждение

Генетически обусловленная высокая устойчивость картофеля к фитофторозу — один из основных критериев подбора исходных родительских форм для скрещиваний и одна из важнейших характеристик сорта. При этом наиболее селекционно ценными являются формы, сохраняющие долговременную устойчивость к патогену в широком диапазоне изменчивости внешних факторов, которые существенно варьируют по годам, во многом определяя развитие растений и реализацию их генетического потенциала.

С 2015 по 2023 год проведена лабораторная оценка устойчивости к фитофторозу 207 образцов из генетической коллекции картофеля. В результате выделен ряд генотипов (31 образец), характеризующихся стабильно высоким проявлением изучаемого признака по годам. Данные их лабораторной оценки по устойчивости листьев и клубней представлены в таблице 2.

По результатам лабораторного скрининга листьев в группу высокоустойчивых выделены 13 образцов со средней оценкой 7,1–8,0 баллов, 5 образцов отнесены в группу устойчивых с оценкой 6,1–7,0 баллов, среднюю устойчивость с оценкой 5,1–6,0 баллов показали 7 образцов, 6 образцов с оценкой менее 5 баллов — низкоустойчивые или восприимчивые.

Следует отметить, что лабораторная оценка складывается как средняя между двумя учетами. В ходе первого учета оценивается степень проникновения патогена. Спустя 24 часа определяют динамику распространения патогена в растительной ткани.

Гибриды с итоговой оценкой менее 5,0 баллов характеризуются средней устойчивостью к проникновению патогена и интенсивным распространением со значительными участками поражения на поверхности листа. При выращивании таких гибридов требуется обработка пестицидами.

Устойчивые и среднеустойчивые генотипы имеют оценку в интервале 5,0–7,0 баллов. На начальном этапе заражения гибриды этой группы имели большую степень проникновения инфекции, но динамика ее дальнейшего распространения была сдержанной.

Высокоустойчивые генотипы демонстрируют реакцию на заражение по типу сверхчувствительности. Такие гибриды хорошо сопротивляются как проникновению, так и распространению патогена в ткани листа.

Другая важная составляющая характеристики фитофтороустойчивости гибридов — это устойчивость их клубней. Из 32 отобранных по результатам лабораторной оценки листьев образцов 24 имеют высокоустойчивые к фитофторозу клубни (табл. 2). В этом ряду обращают на себя внимание генотипы 27-65-11, 27-19-15, 323-1, которые сочетают низкую устойчивость ботвы (4,8, 4,7, 4,3 балла соответственно) и высокоустойчивые клубни (9,0, 7,5 и 8,3 балла соответственно).

Ранее опубликованные данные показывают, что в ответ на заражение фитофторой в клубнях и листьях активируются различные наборы генов, что говорит об органоспецифической реакции. Тем не менее удалось идентифицировать консервативные паттерны ответной реакции, связанные со стрессом и метаболизмом этилена, общие как для клубней, так и для листьев.

Полевая оценка устойчивости ботвы к фитофторозу велась среди генотипов, показавших высокую устойчивость листьев и клубней по результатам лабораторной оценки. Отобранные образцы были охарактеризованы фенотипически по комплексу хозяйственно полезных признаков (табл. 3). У всех генотипов была отмечена устойчивость в интервале 8,0–9,0 баллов, что характеризует их как очень высокоустойчивые.

В то же время многими экспериментальными данными оценки гибридных популяций при искусственном заражении отделенных листьев и в полевых условиях в период эпифитотий фитофтороза подтверждается их идентичность.

В полевых условиях достоверно оценить фитофтороустойчивость можно только в годы эпифитотии болезни, но и в этом случае возможно получить данные по устойчивости лишь к ограниченному числу распространенных в конкретной местности рас патогена. Условия окружающей среды оказывают значительное влияние — температура, осадки и относительная влажность связаны со степенью воздействия патогена на организм растения в полевых условиях.

Различные расы P. infestans могут обладать иными характеристиками в полевых условиях по сравнению с лабораторными. В то же время применение в лабораторных тестах сложного инокулюма, содержащего несколько рас P. infestans, в совокупности с идеальной средой для проникновения и распространения инфекции может давать результаты, не сопоставимые с визуальной оценкой в естественных условиях.

Отобранные по результатам лабораторной и полевой оценки формы картофеля были протестированы по шести маркерам, определяющим наличие пяти R-генов устойчивости к фитофторозу.

В таблице 4 представлены результаты ДНК маркирования генов устойчивости к фитофторозу.

Маркеры генов R1, R2, R3a, R3b ассоциированы с S. demissum. Наиболее редкими в изучаемой выборке являются маркеры гена Rpi-blb1 = Rpi-sto1 (они отмечены у двух образцов с полевыми номерами 4609-15 и 4609-14) (табл. 5). Оба генотипа имеют общее происхождение и были отобраны в потомстве от скрещивания сортов Колобок и Аврора. Допускается, что в родословной этих гибридов могут присутствовать дикие виды S. bulbocastanum и S. stoloniferum, которые, вероятно, являются донорами этих генов. Rpi-blb1 относят к группе наиболее древних, медленно эволюционирующих генов устойчивости.

Ген Rpi-blb1 рассматривают как ген широкого спектра действия, определяющего высокую нерасоспецифическую устойчивость к фитофторозу. Этот ген и его аналоги считаются наиболее перспективными для использования в селекции на устойчивость к фитофторозу. Однако их интрогрессия в селекционный материал сильно затруднена из-за жестких межвидовых барьеров между культурным картофелем и мексиканскими дикими видами картофеля. Введение этого гена в геном S. tuberosum успешно осуществляется посредством соматической гибридизации. Наличие этого гена в культурной геноплазме, несомненно, делает его носителей ценными для селекционного использования, хотя и предполагается, что его экспрессия не достигает уровня, наблюдаемого у диких видов — доноров гена.

По количеству ассоциированных с R-генами маркеров получены следующие результаты: 5 генотипов (2584-29, 4700-81, 2778-45, 4609-15, 4691-2) имеют 4 маркера генов устойчивости, 8 генотипов — 3 маркера, 9 генотипов — 2 маркера, 6 генотипов — 1 маркер,. У 3 генотипов, включая отрицательный контроль, не было определено ДНК-маркеров.

Наиболее распространенным маркером, выявленным среди изучаемых образцов, является R3b. Он присутствует в генотипе 21 гибрида, преимущественно в сочетании с маркерами других генов. R3b и R3a — расоспецифичные гены устойчивости, первоначально идентифицированные у S. demissum. Данные гены являются членами сложного локуса R3 на хромосоме XI. При этом гены R3b и R3a функционально различимы и распознают разные эффекторы. R3a относится к быстро эволюционирующим генам.

В других исследованиях по генотипированию коллекций картофеля было продемонстрировано, что наличие маркеров генов устойчивости к фитофторе значительно коррелировало с лабораторной устойчивостью, что согласуется с полученными данными авторов. Генотипы, несущие по 4 гена, характеризовались высоким уровнем устойчивости к искусственному заражению. Таким образом, сочетание различных генов устойчивости может оказывать аддитивный эффект на горизонтальную устойчивость к P. infestans.

Уровень устойчивости может быть связан с комбинацией R-генов. Некоторые исследователи отмечают, что наличие маркера гена R1 высоко коррелирует с устойчивостью, в то время как наличие маркеров R2 или R3a не демонстрирует значимых корреляций.

Несмотря на наличие маркеров генов устойчивости почти у всех отобранных образцов, всегда можно установить прямую зависимость лабораторной устойчивости листьев и клубней от наличия маркеров Rpi-генов и их количества. Так, образцы 2714-71, 2584-29 характеризуются как устойчивые, несмотря на отсутствие соответствующих маркеров. В группе, где выявлен только один маркер генов устойчивости, из 6 образцов 3 были описаны как высокоустойчивые, 2 — устойчивые, 1 — среднеустойчивый. При этом только у среднеустойчивого присутствует ген R3b, остальные несут ген R2.

Для повышения эффективности отбора в процессе селекции необходимо, чтобы выделенный генетический источник высокого уровня целевого признака (фитофтороустойчивости) не только мог передавать свой высокий уровень наибольшему количеству гибридов, но наряду с этим обладал бы нужным уровнем других хозяйственно ценных признаков, то есть он должен быть комплексным. В связи с этим необходимо на этапе предселекции не только отбирать высокоустойчивые к патогену формы, но и на их основе создавать новые генетические источники, которые характеризуются высоким уровнем и стабильностью проявления хозяйственно ценных признаков.

В таблице 3 представлена характеристика выделенных по высокой фитофтороустойчивости форм картофеля по параметрам клубней, продуктивности, содержанию крахмала, органолептическим показателям. Из данных видно, что образцы отличаются высокой вирусоустойчивостью, средним и высоким содержанием крахмала (более 16%), хорошими вкусовыми качествами клубней.

Селекционная ценность любого генетического источника по-настоящему может быть определена по результатам его использования для создания исходной формы или нового сорта. Получение этой информации требует значительного периода времени — от скрещивания и выращивания сеянцев до конца селекционного цикла.

Выводы

Использование в лабораторных тестах рас фитофтороза, не характерных для полевых популяций данного региона (с учетом возможности потенциальной миграции патогена), позволяет вести отбор устойчивых генотипов на перспективу.

На данном этапе не представляется возможным делать отбор фитофтороустойчивых генотипов, основываясь только на молекулярных маркерах. С одной стороны, необходимо повысить точность такого отбора за счет увеличения количества идентифицируемых генов, с другой — наблюдается большой вклад полигенного контроля устойчивости. Тем не менее сочетание традиционной и молекулярной составляющей оценки позволит пирамидировать гены в одном генотипе.

С использованием молекулярных маркеров в сочетании с лабораторной и полевой оценкой в рамках данной работы был выделен 31 гибрид, несущий R-гены, отличающийся высокой фитофтороусточивостью клубней и ботвы и обладающий комплексом хозяйственно полезных признаков. Такие генотипы могут оказаться перспективными для выведения новых сортов картофеля. Они могут быть использованы в различных программах селекции для получения устойчивых к фитофторозу форм.

Таким образом, сформирована коллекционная группа генотипов, гибриды которой наряду с комплексом хозяйственно ценных параметров обладают устойчивостью к фитофторозу на уровне или превышающей лучшие мировые стандарты. Выделившиеся генетические источники высокой устойчивости к фитофторозу рекомендованы для использования в селекции.

Об авторах

Олег Геннадьевич Казаков1; кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник

kazakov-og@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-4131-3965

Оксана Борисовна Поливанова1, 2; кандидат биологических наук, научный сотрудник1; кандидат биологических наук, научный сотрудник2

polivanovaoks@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-3992-5452

Марина Константиновна Деревягина1; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

vzeyruk@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-4131-3965

Виктория Александровна Бирюкова1; кандидат биологических наук, ведущий сотрудник

vika_biryukova@inbox.ru; https://orcid.org/0000-0001-7521-6883

1Федеральный исследовательский центр картофеля им. А.Г. Лорха, ул. Лорха, 23В, д. п. Красково, г. о. Люберцы, Московская обл., 140051, Россия

2Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева, ул. Тимирязевская, 49, Москва, 127550, Россия

УДК 635.21:632.4:631.524:577.21
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-388-11-109-116